BIOAEROSOLES ALERGÉNICOS DE PESCADO
Jesús F. Crespo*, Adela V. Taylor*, Mark C. Swanson*, Richard T. Jones*, Ramón Vives*, Julia Rodríguez*, John W. Yunginger*
*Servicio de Alergia, Hospital Universitario Doce de Octubre (Madrid)
**Mayo Graduate School of Medicine, the Department of Pediatrics and Adolescent Medicine and the Allergic Diseases Research Laboratory and Mayo Clinic and Foundation (Rochester, EEUU)

Introducción

El pescado: un alergeno alimentario 'precoz'
Desde una perspectiva histórica, la alergia a pescado ha jugado un importante papel en el avance del estudio de las enfermedades alérgicas. En 1921, el suero de un alérgico a pescado, Kustner, fue inyectado en la piel de un no alérgico a dicho alimento, Prausnitz; 48 horas después el lugar de inyección fue inoculado con un extracto de pescado. Esto origino una respuesta de pápula y eritema y demostró, por primera vez, la presencia de anticuerpos reagínicos dirigidos frente a un alergeno específico en el suero. Sin embargo, este experimento también demostró que la alergia a pescado está mediada por anticuerpos reagínicos (IgE).
Aunque la mayor parte de las reacciones alérgicas a pescado son causadas por la ingestión de dicho alimento, desde 1937 (De Besche) se conoce la capacidad de los alergenos de pescado para desencadenar asma por inhalación y urticaria inmediata por contacto1. Los estudios de Aas2,3 a finales de los sesenta y principios de los setenta dilucidaron algunas de las principales características clínico-inmunológicas de la alergia a bacalao y el elevado grado de reactividad cruzada entre diversas especies. Poco después se purificó y caracterizó la parvalbúmina de bacalao como el principal alergeno de pescado (alergeno M), designado actualmente como Gad c 14. Está formado por 113 aminoácidos y 1 molécula de glucosa, con un peso molecular de 12.328 D y un punto isoeléctrico de 4,75. Habrían de pasar casi 20 años para que otro alergeno alimentario fuera estudiado desde el punto de visto inmunoquímico al mismo nivel.
En España, a finales de los años ochenta Pascual et al.5 realizaron una serie de estudios sobre la alergenicidad de varias especies de pescado (gallo, lenguado, merluza, bacalao y atún) de consumo habitual en nuestro medio. Más del 90% de los sujetos presentaban anticuerpos IgE específicos frente a merluza, gallo y bacalao. Por el contrario, el atún fue identificado como la especie menos reactiva. El comienzo de la alergia a pescado ocurría con mayor frecuencia entre los 7 y 12 meses del primer año de vida. El síndrome clínico más frecuente asociado a la alergia a pescado fue la aparición de episodios agudos de urticaria/angioedema (92%). Sin embargo, 11 (14%) de los 79 pacientes estudiados referían manifestaciones respiratorias (rinoconjuntivitis, asma) relacionados con la inhalación de humos o vapores generados durante el procesamiento culinario del pescado, en ausencia de la ingestión de dicho alimento. Los estudios inmunológicos (RAST y western blot inhibición) confirmaron la existencia de una comunidad alergénica basada en las parvalbúminas. Sin embargo, las diferencias estructurales intraespecie en las parvalbúminas serían responsables de la distinta capacidad para inducir reacciones de hipersensibilidad inmediata por parte especies distintas. Así, mientras que la parvalbúmina Gad c 1 es un alergeno importante en el bacalao, su importancia es significativamente menor en otros pescados como merluza y gallo. Esto explicaría la tolerancia selectiva a algunas especies en pacientes alérgicos a pescado.
La hipersensibilidad a pescado mediada por IgE es un problema clínicamente relevante, particularmente en varios países Europeos. En Noruega, donde la industria del pescado representa un sector estratégico de la economía y dicho alimento, principalmente el bacalao, es un elemento principal de la dieta, se ha descrito una prevalencia de alergia a pescado de 1/1000 en la población general6. En Suecia, el 39% de todos los pacientes pediátricos con alergia a alimentos lo serían a pescado7. En España, en una serie de 355 niños diagnosticados de alergia alimentos, 108 (30,4%) fueron diagnosticados de alergia a pescado, representando la segunda causa más frecuente de alergia alimentaria en la infancia, después del huevo8.

Alergia a pescado sin comer pescado: ┐alergenos ambientales?

1) Descripciones clínicas
La inhalación de alergenos alimentarios puede desencadenar síntomas respiratorios, más raramente cutáneos, particularmente en relación con actividades laborales. Además de la clásica asma del panadero, debida a la exposición ocupacional a harinas y otras fuentes alergénicas, distintos alimentos se han descrito como causa, fundamentalmente, de asma ocupacional al ser vehiculizados en forma de polvo procedente de diferentes vegetales (soja9, cacahuete10, espárrago11, cebolla12, ajo13, especias14), polvo y aerosoles de huevo15,16, leche en polvo17 y mariscos18. Para otros alimentos, la inducción de manifestaciones alérgicas por inhalación se ha relacionado con la exposición a vapores generados activamente. La exposición a vapores de cocción de leguminosas como las judías verdes, lentejas, garbanzos y guisantes ha sido descrita como causa de crisis de asma19,20. Mediante provocación bronquial específica se ha objetivado el papel causal de la lenteja y el garbanzo21, judía verde22 y judía verde y acelga23,24 en casos aislados; particularmente, en amas de casa que manipulan y están expuestas a vapores de cocción de estos alimentos durante su preparación culinaria. En una serie, 3 de 20 sujetos con alergia clínica a lenteja referían síntomas con la exposición a vapores de cocción de este alimento25. Diversas especies de crustáceos han sido identificadas como causa de asma ocupacional en pescadores, cocineros y en trabajadores de plantas de procesamiento de mariscos. El asma ocupacional en relación con el procesamiento de cangrejo (snow crab) se ha estudiado con detalle en varias factorías. La sensibilización de los trabajadores ocurrió por la exposición a los vapores de cocción de dichos crustáceos26.
Aunque la mayoría de las reacciones alérgicas a pescado se producen por ingestión, se han comunicado algunos casos debido a la exposición por vía inhalatoria a pescado. Droszcz et al.27 refieren que 2 de 51 trabajadores en una factoría de pescado presentaban síntomas alérgicos (rinitis y síntomas cutáneos) y pruebas cutáneas positivas a pescado. Sherson et al.28 comunicaron 5 casos de asma ocupacional en trabajadores dedicados al procesamiento de truchas. Posteriormente, nuestros estudios demostraron la existencia de manifestaciones clínicas por la posible inhalación de partículas de pescado fuera del ámbito ocupacional29,30. De 197 niños que evitaban estrictamente la ingestión de pescado por haber sido diagnosticados de alergia a este alimento, 21 (10,6%) referían múltiples reacciones alérgicas por la inhalación accidental o incidental de vapores o humos generados al cocinar pescado o en relación únicamente con la exposición a dicho alimento. Estas reacciones ocurrieron principalmente en el domicilio de los pacientes, 13 pacientes sufrieron episodios fuera de la cocina cuando otras personas estaban comiendo pescado y 7 presentaron estos cuadros en la cocina cuando alguien estaba cocinado o manipulando pescado. También se identificó la aparición de síntomas por contacto cutáneo con pescado en 29 de los 197 niños evaluados31. Rodríguez et al.32 describieron dos pacientes adultos diagnosticados de asma ocupacional por pescado mediante determinaciones seriadas de PEFR (en/fuera del trabajo) y provocación bronquial específica con extractos aerosolizados de pescado (salmón, platija, atún y merluza en un caso y salmón en el otro). Uno de los pacientes desarrolló, años después, síntomas con la ingestión de pescado. La actividad laboral de dichos pacientes consistía en la limpieza, troceado y empaquetado de varias especies de pescado en una empresa de pescado congelado en un caso y en una empresa de ahumado en el otro. Douglas et al.33 en un estudio epidemiológico realizado en una factoría dedicada al procesamiento de salmón identificaron 24 (8,2%) empleados con asma ocupacional. Los trabajadores realizaban su actividad en la proximidad de aparatos que generaban aerosoles que contenían proteínas séricas de salmón. La existencia de respuestas IgE a esas proteínas se asoció significativamente con asma ocupacional, con una mayor severidad de los síntomas y con la distancia a la fuente generadora de aerosoles.
Por tanto, al igual que se había descrito para otros alimentos, la exposición a vapores de pescado generados activamente por calentamiento, podría tener algún papel causal en la sensibilización y en el desencadenamiento de manifestaciones clínicas inesperadas en sujetos con alergia a pescado. Además, la generación pasiva de bioaerosoles por evaporación natural en áreas, principalmente, de almacenamiento de pescado, industria o en pescaderías, podría facilitar la presencia de material alergénico de pescado en el ambiente. En varios trabajos experimentales se ha abordado el estudio de la alergenicidad de bioaerosoles de pescado procedentes de la cocción de pescado y de la detección y cuantificación de aeroalergenos de pescado generados de forma espontánea.

2) Bioaerosoles de pescado: análisis experimental
a- Aeroalergenos generados por la cocción de pescado (vapores)34
Para evaluar la alergenicidad de los vapores procedentes de pescado se diseñó un modelo experimental mediante la generación activa de vapores de cocción de pescado (salmón), recogidos mediante un destilador. La alergenicidad de las muestras obtenidas mediante evaporación activa fue comparada con el extracto de salmón crudo y cocido, utilizando un pool de sueros de 20 pacientes alérgicos a pescado. Mediante procedimientos de RAST inhibición se demostró la estrecha relación antigénica entre el extracto de salmón cocido y el material obtenido por evaporación. Mediante immunoblot se demostraron múltiples componentes reconocidos por anticuerpos IgE en el material obtenido por evaporación, la mayor actividad alergénica se identificó en doble banda en el rango de 12-14 kD y alrededor de 30 kD. En estudios de inhibición de immunoblotting, los extractos de salmón cocido y material obtenido por evaporación activa se inhibían completamente, pero sólo inhibían parcialmente al extracto de salmón crudo. Por tanto, es posible detectar componentes alergénicos en vapores procedentes de la cocción de salmón y presumiblemente estos hallazgos pueden ser extensivos a otras especies de pescado e incluso a otros alimentos.

b- Detección y cuantificación de aeroalergenos de pescado generados por un posible mecanismo de evaporación pasiva35
Las evidencias clínicas de que algunos pacientes alérgicos a pescado presentaban manifestaciones clínicas, incluso con la presencia en su proximidad de pescado o incluso con el olor, fueron la base para diseñar un estudio para detectar proteínas de pescado aerosolizadas mediante evaporación pasiva a partir de pescado crudo. Se colocó un aparato (volumetric air sampler, Quan-Tec-Air, Inc, Rochester, Minn, EEUU) capaz de generar un flujo aéreo de 2,5 l/seg a través de filtros de politetrafluoroetileno (PTFE) en un puesto de pescadería, localizada en un mercado de Madrid (Fig. 1). El aparato se situó, al menos, a dos metros de distancia de la ubicación del pescado. Cada día (lunes a sábado), y durante 39 días repartidos en los meses de noviembre de 1996 y febrero de 1997, se colocó un filtro PTFE en el aparato. Se obtuvieron posteriormente muestras control en una zona residencial de Madrid y en el área portuaria de Barcelona. El material alergénico de cada filtro se recupero mediante elución en 1 ml de PBS-Tween-20 (1%). Se prepararon extractos alergénicos de gallo y merluza crudos y cocidos y de cangrejo (antígeno control). Para los radioinmunoanálisis se utilizó un pool de sueros de 19 pacientes alérgicos a gallo y merluza.
El primer experimento consistió en un RIA inhibición en el que concentraciones decrecientes de una mezcla de extractos de gallo y merluza crudos, cocidos y cangrejo (snow crab) fueron incubadas con un suero pool con anticuerpos IgE a pescado. A continuación se determinaron los niveles de IgE específica frente a pescado mediante radioinmunoanálisis, utilizando la mezcla de extractos de gallo y merluza crudos como fase sólida. Los resultados expresados como % de inhibición se muestran en la Fig 2. Tanto mezcla de extractos de gallo y merluza crudos como cocidos inhibieron la unión de IgE de forma dosis-dependiente y no se obtuvo inhibición significativa con el extracto de cangrejo.
El segundo grupo de experimentos consistió en el análisis y cuantificación de material alergénico de pescado en muestras individuales obtenidas de cada uno de los filtros expuestos en la pescadería. Se realizó mediante RIA inhibición, utilizando la mezcla de extractos de gallo y merluza crudos como fase sólida y como referencia para la cuantificación del material presente en cada uno de los filtros expuestos. El material eluido de cada uno de los filtros expuestos fue incubado con el suero pool, compitiendo con la mezcla de extractos de gallo y merluza crudos por la fijación de anticuerpos IgE. Los resultados fueron expresados como masa de proteína por metro cúbico de aire (Fig. 3a y 3b). La sensibilidad del ensayo fue de 2 ng, permitiendo una detección de aproximadamente 0,4 ng/m3. Se detectó material alergénico de pescado en cada una de las 39 muestras obtenidas de los filtros expuestos en la pescadería. No se detectaron alergenos de pescado en ninguna de las 8 muestras procedentes de un área control, sin exposición a pescado, de Madrid. La cantidad de aeroalergeno detectado parece ser independiente de la duración de la exposición del filtro. Es probable que variables como las condiciones microclimáticas, las corrientes de aire, la cantidad de pescado en la pescadería y el día de la semana puedan influir en la cantidad de alergeno detectada en el aire.
El tercer grupo de experimentos consistió en la comparación del material alergénico obtenido de los filtros expuestos y la mezcla de extractos de gallo y merluza crudos. Se preparó un pool con volúmenes similares del material obtenido de cada uno de los filtros. Dicho material fue dializado y liofilizado, siendo reconstituido a concentraciones 20-30 veces superiores. Se utilizaron concentraciones crecientes de este material en RIA inhibición utilizando la mezcla de extractos de gallo y merluza crudos como fase sólida. Las muestras concentradas del material obtenido de los filtros expuestos en la pescadería mostraron una reactividad dosis-dependiente similar a la mezcla de extractos de gallo y merluza crudos utilizada como estándar (Fig. 4).
En conjunto, nuestro estudio demostró la presencia ambiental de componentes alergénicos de pescado en el área de una pescadería y su ausencia una zona control. Además, las pendientes de las curvas dosis-respuesta de muestras ambientales obtenidas en una pescadería y de una mezcla de extractos alergénicos de gallo y merluza crudos no difieren significativamente, lo que demuestra la identidad alergénica y la validez de las cuantificaciones. Es interesante destacar que las concentraciones de aeroalergenos de pescado se encuentran en el mismo orden de magnitud (10 - 1000 ng/m3) que otros aeroalergenos ocupacionales como el látex36 o aeroalergenos de cangrejo37. Posiblemente, se detecten niveles similares en otros lugares donde se encuentre pescado, como industrias o factorías de pescado, pescaderías y otros puntos de venta o comercio mayorista de pescado crudo, restaurantes, etc.
En conclusión, nuestros estudios han demostrado experimentalmente la presencia de aeroalergenos de pescado en vapores procedentes de cocción y en forma de bioaerosoles posiblemente generados por un mecanismo de evaporación pasiva. Por tanto, la evitación de alergenos alimentarios, como los de pescado, debe incluir no sólo la evitación de este alimento de la dieta, sino también la prevención de la exposición inhalatoria a partículas aerosolizadas.

Agradecimientos
Dr. Enrique Fernández Caldas, Dr. Manuel Martín Esteban, Dra. Cristina Pascual Marcos, Sofía Sánchez Pastor, Mary Lou Clawson y Dr. Charles E. Reed.

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