La apoptosis de linfocitos como mecanismo de inducción de tolerancia con extractos alergénicos.

Prof. F. Guerra Pasadas.

Servicio de Alergia

Hospital Universitario Reina Sofía. Córdoba.

Nuestro grupo mantiene desde hace años, como línea de investigación preferente el estudio de la inmunoterapia con extractos alergénicos. Fruto de ello, ha sido la realización de varias tesis doctorales, que se han plasmado en artículos científicos y comunicaciones a congresos nacionales e internacionales (1,2,3,4,5). El objetivo fundamental de estos trabajos, se ha centrado en la búsqueda de un parámetro biológico que nos sirviera como control de eficacia, sin renunciar a profundizar en el mecanismo de acción de este recurso terapéutico.

Experiencias previas sobre apoptosis en otros modelos biológicos del grupo de investigación del Hospital Universitario Reina Sofía, (6), nos hizo plantearnos si este mecanismo podía estar implicado en el cambio de respuesta que experimentaban nuestros pacientes sometidos a inmunoterapia.

Tras unos intentos fallidos, en los que analizamos la apoptosis, a nivel de sangre periférica, de diferentes células: linfocitos (T y B), monocitos y polimorfonucleares en pacientes sometidos a inmunoterapia con extractos alergénicos (IT) en comparación con pacientes alérgicos no tratados e individuos no alérgicos, nos centramos en el estudio, como modelo biológico, de la apoptosis de linfocitos de pacientes y controles, tras estimulación en cultivo con el antígeno al que estaban sensibilizados y recibiendo en la IT.

Con este modelo pudimos demostrar que los alérgenos de Olea europaea y Lollium perenne, inducen in vitro apoptosis en linfocitos CD4 + y CD45RO+ de individuos alérgicos tratados con IT específica con los mismos alérgenos (7) y posteriormente que esta apoptosis es altamente específica del antígeno y que afecta a los linfocitos Th2 productores de IL-4 (8). Por lo que hemos postulado que el mecanismo básico por el que actúa la IT con extractos alergénicos se basa en que la estimulación mantenida de las células memoria inmunocompetentes activa una cascada de eventos intracelulares que llega a inducir la muerte por apoptosis en un proceso denominado “muerte celular inducida tras activación” (AICD) que podría estar ligado a un descenso en la actividad telomerasa de estas células que evoca un mecanismo muy similar a la inmunodeficiencia asociada a la senescencia (9).

Desde el punto de vista biológico la Alergia es una respuesta T-mediada exacerbada ante una molécula (antígeno) inocua para la mayoría de la población. Aunque no sabemos con certeza si es o no inmunológica, la respuesta que pone en marcha un individuo normal ante estas sustancias, lo cierto es que es inespecífica , puesto que no deja memoria y por tanto no se sensibiliza.

La respuesta celular, se inicia con la fagocitosis del alergeno por la célula presentadora de antígenos (APC) que lo presenta a un linfocito Th0 como un péptido unido a un antígeno mayor de histocompatibilidad de clase II, tras esa presentación se recibe una señal de la APC mediada por citoquinas diferentes que dependen de la naturaleza del antígeno. Fundamentalmente sabemos, que si predomina la producción de Interferón gamma (IFN) se activarán y proliferaran linfocitos Th1 que a su vez activarán una población de linfocitos T citotóxicos que serán la base de una respuesta inmune celular dirigida contra el antígeno. Si la citoquina predominante es la IL-4, en este ambiente, se activarán linfocitos Th2 que actuarán sobre linfocitos B que se transforman en células plasmáticas dando lugar a la producción de anticuerpos específicos dependiendo del tipo de antígeno, es esta una respuesta humoral, que en el caso de la respuesta alérgica es del isotipo IgE. (Fig. 1).

El fenotipo Th1 viene caracterizado por múltiples citoquinas, pero las más importantes son IL-1, IL-2, IFN y TNF y en la respuesta Th2 igualmente participan varias citoquinas, pero las más importantes son IL-4 e IL5.

Es la persistencia del antígeno lo que permite que la señal continúe, haciendo que tras la activación Th2 se origine la proliferación celular, quedando un clon de células con memoria específica del antígeno que las ha originado. Ante un nuevo contacto (Fig. 2), estos linfocitos Th2 producen la IL-4 que actuando sobre los linfocitos B, a través del receptor específico, lo activa transformándolo en una célula plasmática que sintetiza anticuerpos IgE específicos.

Estos anticuerpos ligados al mastocito, a través de su fragmento Fc, captan al antígeno. El antígeno, con al menos dos epítopos, es capaz de unir en la membrana de la célula diana dos moléculas de IgE, este entrecruzamiento o banding es lo que produce la activación del mastocito dando lugar a la liberación de mediadores, como respuesta inmediata, que genera un fenómeno inflamatorio de mayor o menor intensidad dependiendo de la hiperreactividad del órgano de choque. Al mismo tiempo es el propio linfocito Th2, a través de la producción de IL-5, actuando principalmente sobre el eosinófilo, junto a mediadores quimiotácticos para polimorfonucleares, el responsable de la fase tardía de la reacción inflamatoria y del daño epitelial, con infiltrado de eosinófilos y neutrófilos y depósito de fibrina. Para el desarrollo de cada uno de estos acontecimientos biológicos es indispensable la participación de las moléculas de adhesión.

Pero como vemos en la Fig. 3, el paciente alérgico no es hiperrespondedor inespecífico, ya que ante el estímulo de un mitógeno como la fitohemaglutinina (PHA) responde con la misma intensidad que el control no alérgico, sino que tiene una hiperrespuesta altamente específica, no respondiendo, al igual que el control, a un alergeno al que no está sensibilizado.

Si analizamos las células que han proliferado en el cultivo de linfocitos, tras estímulo con PHA valorando las citoquinas intracelulares, (utilizando una solución permeabilizante de la membrana celular y anticuerpos monoclonales anti IL-4), vemos mediante citometría de flujo que el 32.5 % de las células que han proliferado son productoras de IL-4 y si se estimulan con el alergeno este porcentaje pasa al 57.3 %. Así mismo si fijamos las células con el alergeno, vemos mediante citometría de flujo que de las células que fijan el alergeno el 67 % producen IL-4 en contraste con el 5 % en el grupo control de células que no fijan el alergeno (Fig. 4), lo que pone de manifiesto que en el paciente alérgico los linfocitos Th2 productores de IL-4 se activan y proliferan de forma específica frente al alergeno.

¿Esta célula es clave en la respuesta alérgica por ser hipeproductora de IL-4 o por otra propiedad biológica?. Sabemos que existe una fuerte correlación entre IL-4 y producción de IgE específica (Fig. 5) por lo que parece que lo importante es la interleuquina, sin embargo el aspecto central de la respuesta biológica que estamos analizando es el conjunto Th2-interleuquina.

Nosotros podemos valorar el perfil de citoquinas, en el suero de los individuos, para caracterizar una respuesta. En el paciente alérgico en comparación con el individuo control no alérgico, encontramos un incremento significativo de IL-2, IL-4 e IL-5, que definen un perfil Th2, no encontrando diferencias en el nivel de factor de necrosis tumoral (TNF) e interferón (IFN) que definen un perfil Th1. El mismo perfil de linfoquinas lo podemos valorar en cultivo de células inducido por PHA, como vemos en la Fig. 6. Podemos observar cómo no existe diferencia en el nivel de las distintas interleuquinas en el sobrenadante del cultivo tras estimulación con PHA en los pacientes alérgicos y los controles, es decir las células de nuestros pacientes tienen la misma capacidad para producir cualquier tipo de citoquina, no solo las que configuran un perfil Th2.

Un problema importante que encontramos en la valoración de citoquinas, es que los métodos clásicos (ELISA, IRMA...) solo permiten determinar citoquinas solubles en grandes volúmenes (ml) y son poco sensibles. Por otra parte numerosas patologías (infecciones, inflamaciones...) alteran en un momento dado el patrón de citoquinas séricas, por ello nuestro grupo utiliza como método el CBA-BD (Citometry Bead analisys) que es un micrométodo que ha demostrado una gran sensibilidad y bajo costo y permitiendo procesar muestras de hasta 50 ul.

El CBA-BD (Fig. 7) utiliza unas microesferas de diferentes colores, cada color lleva fijado un anticuerpo anti-interleuquinas distinto. Nosotros las incubamos con el suero del paciente, las interleuquinas se fijan a su anticuerpo y posteriormente añadimos un anticuerpo marcado con un fluorocromo. Nosotros valoramos las esferas por citometría de flujo como si fueran células y el color y la fluorescencia determinan el tipo de interleuquina, permitiendo la valoración de hasta 6 interleuquinas en un mismo ensayo, con 50 ml de muestra, lo que permite valorar interleuquinas no solo en sangre sino en otros fluidos biológicos como saliva, moco, lágrimas, etc... y su utilización de forma más rutinaria.

Con este método hemos podido observar cómo, en la valoración de distintas interleuquinas en nuestros pacientes alérgicos, el perfil Th2 se manifiesta más claramente en saliva que en el suero, como vemos en la Fig. 8. Así mismo observamos el caso de un paciente que por tener una infección concomitante, tenía elevado en sangre el TNF e IFN (perfil Th1) lo que no ocurre en la valoración en la secreción salival. Con un método clásico esta diferenciación no hubiese sido posible.

Es un hecho conocido que los pacientes alérgicos presentan un disbalance Th1/Th2 con incremento de citoquinas Th2 y que este disbalance se corrige con la inmunoterapia (10,11). ¿Qué correlación existe entre la Biología Celular que hemos analizado y la inmunoterapia con extractos alergénicos?.

Nosotros hemos observado, midiendo las diferentes interleuquinas a nivel intracelular, en un grupo de 20 pacientes alérgicos en tratamiento con IT a Olea y Lollium, comparándolo con un grupo control de igual número con idéntica sensibilidad y 10 controles no alérgicos (Fig. 9), que existen diferencias estadísticamente significativas tras estimulo con el alergeno al que están sensibilizados, en los niveles intracelulares de IL-4 e IL-5, en pacientes con y sin IT, disminuyendo estos niveles en los pacientes con IT hasta ser similar a los controles no alérgicos. Así mismo se objetiva una disminución en la proliferación celular en los pacientes con IT, si embargo al estimular inespecíficamente con PHA el comportamiento es similar en los tres grupos.

Es decir, en los pacientes sometidos a IT con extractos alergénicos bien estandarizados, tras estimular sus linfocitos con el antígeno que están recibiendo en el tratamiento se objetiva una disminución en la proliferación celular y un descenso de las citoquinas de perfil Th2 intracelulares, ¿A qué se debe este cambio biológico?, ¿Cuál es el mecanismo de acción de la inmunoterapia?.

Pudimos observar mediante electroforesis del DNA en gel de agarosa en distintos tiempos el típico patrón en escalera del DNA degradado al valorar los linfocitos de los pacientes sometidos a IT, lo que no ocurría con los pacientes alérgicos no tratados y los controles, igualmente lo objetivamos mediante otros dos métodos que valoran apoptosis (Citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido) (Fig. 10). Es decir los linfocitos de los pacientes alérgicos sometidos a IT, entraban en un proceso de apoptosis, al ser estimulados con el antígeno y este porcentaje de apoptosis era claramente diferente a los controles.

Posteriormente empleamos como marcador de apoptosis la Anexina V. Esta técnica se basa en que al originarse la apoptosis se altera la membrana celular de forma temprana (12), afectando a los fosfolípidos, exponiéndose al exterior la anexina que puede ser marcado con moléculas conjugadas con fluorocromos, esto permite a su vez el marcaje de las células con un anticuerpo para caracterizarlas (Fig. 11). Empleamos anticuerpos anti- IL-4 y anti- IFN y pudimos demostrar que las células que morían por apoptosis eran IL-4 +.

Para demostrar que las células Th2 que iban desapareciendo mediante el mecanismo de apoptosis eran específicas del antígeno, estudiamos el modelo de IT a veneno de himenópteros que nos permitía utilizar un antígeno mejor caracterizado y fácil de manejar como es la fosfolipasa A2 (PLA2). No pudimos emplear el método de la Anexina V para valorar la apoptosis ya que al ser ambos de naturaleza fosfolipídica producía interferencias técnicas, empleando en este caso el método TANEL ( Tdt-mediated X-dUTP nick end labeling) (Boehringer Mannheim) que aprovecha la fragmentación del DNA, marcando cada fragmento terminal con una desoxinucleotidil transferasa terminal modificada (10) (Fig. 12) poniéndose en evidencia que solo se objetivaba apoptosis en las células marcadas con PLA2 de los pacientes que estaban recibiendo inmunoterapia y no en los pacientes alérgicos a veneno de himenópteros no tratados. (13)

Nuestros hallazgos, por tanto, parecen demostrar que el mecanismo por el que puede actuar la IT específica con extractos alergénicos, puede deberse a que el estímulo antigénico mantenido y a dosis suficientes, está eliminando el clon de células respondedoras Th2 específicas del antígeno, actuamos a nivel central produciendo una inmunotolerancia. Estamos cortando la respuesta biológica específica, hecho que ha tenido repercusión en la bibliografía especializada (14)

Esto tiene una trascendencia clínica evidente ya que, en determinados modelos de IT, nos permitiría valorar la eficacia y monitorizar la cinética de los cambios. En otros modelos como la polinosis, la mono o polisensibilidad y la posibilidad de reactividad cruzada, hace que la eficacia de la IT pueda ser muy variable, pero el mecanismo parece ser muy selectivo.

La complejidad de los diferentes métodos para valorar apoptosis, hace que desde el punto de vista del laboratorio busquemos otros modelos de trabajo para valorar tanto la eficacia de la IT en nuestros pacientes como la posibilidad de prever aquellos pacientes que pueden tener reacciones adversas a la misma.

Actualmente podemos valorar la cinética de los cambios en el perfil Th1/Th2 mediante la determinación de citoquinas solubles a nivel sérico y local (moco, lágrimas, saliva) mediante el CBA-BD y tras activación y proliferación celular frente al alergeno, pero las enfermedades alérgicas tienen un componente genético importante, no existen estudios concluyentes de alteraciones genéticas asociadas a las enfermedades alérgicas por lo que cabe plantearse si el polimorfismo génico de citoquinas puede condicionar la respuesta al alergeno y/o a la inmunoterapia, tanto desde el punto de vista de la eficacia como de la tolerancia a la misma.

BIBLIOGRAFIA

1) Linear monitoring of patients sensitive to olea and gramineal pollens treated with immunotherapy based on glutaraldehide-modified (Allergoid) extracts. Guerra F. Moreno C., Daza JC., Miguel R., García M., Sanchez Guijo P. J. Invest. Allergol Clin Inmunol 3:182, 1993.

2) Linear monitoring during 4 years of immunotherapy in pollinosis (Allergoid VS. U.B. Retard Extract) Guerra F., et al. Allergy 16:67, 1993.

3) Initial evaluation of follow-up index for immunotherapy in patients allergic to gramineae. Arenas A., Guerra F., Daza JC., Miguel R., Aviles C., Sanchez Guijo P.. Allergy. 48-16:66, 1993.

4) Inmunoterapia con un extracto de alternaria en el asma infantil. Eficacia clínica, seguridad, repercusiones sobre parámetros in vivo e in vitro. A Criado, F. Guerra Pasadas y otros. Allergol et Inmunopathol. 30(6): 319-

5) Immunotherapy with Depigmented Polymerized vaccine of Olea europaea significantly reduces specific bronchial and skin test reactivity in sensitizad patients after one year of treatment. Francisco guerra, Juan Carlos Daza, Aduardo Almeda. Journal of Invest. Clin Inmunol. Acept. (en prensa)

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Th2 lymphocytes from atopic patients treated with immunotherapy undergo rapid apoptosis after culture with specific allergens. Francisco Guerra, Julia Carracedo, Rafael Solana-Lara, Pedro Sanches Guijo and Rafel Ramirez. J. Allergy Clin Immunol. 107 (4): 647. 2001.

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9) The kinetics of change in cytokine production by CD4 T cells during conventional allergen immunotherapy. Benjaponpitak S, Oro A, Maguire P, Marinkovich V, DeKruyff RH, Umetsu DT. J Allergy Clin Immunol. 1999;103(3):468-75.

10) Specific immunotherapy prevents increased levels of allergen-specific IL-4- and IL-13-producing cells during pollen season. Gabrielsson S, Soderlund A, Paulie S, van der Pouw Kraan TC, Troye-Blomberg M, Rak S. Allergy. 2001;56(4):293-300.

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12) Induction of replicative senescence in allergen responder cells: A role for an immunotherapy mechanic. Moreno C., Guerra F., Carracedo J, Jimenez R., Sanchez Guijo P, Ramirez R. (en prensa)

13) Allergy immunotherapy and inhibition of Th2 immune responses: a sufficient strategy?. Lewis DB. Curr Opin Immunol. 2002;14(5):644-51.